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產(chǎn)品簡介
諾如病毒G1型探針法熒光定量RT-PCR試劑盒：諾如病毒（Norwalk Virus）是單股正鏈 RNA 病毒，屬于人類杯狀病毒屬，是一種引起非細菌性急性腸胃炎的病毒，如諾病毒感染性強，以腸道傳播為主，通過口-糞傳播，以污染的水源、食物、貝類、物品、空氣作為主要傳播載體。諾如病毒可分為 G I-G 五個基因群，其中引起人類感染的主要是 G1 和 G2 群。因此快速靈敏診斷具有重要意義。
產(chǎn)品分類
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產(chǎn)品名稱：諾如病毒G1型探針法熒光定量RT-PCR試劑盒
Name：Norwalk Virus G1(NV-1) RT-PCR Kit
包裝規(guī)格：50T/盒。
諾如病毒（Norwalk Virus）是單股正鏈 RNA 病毒，屬于人類杯狀病毒屬，是一種引起非細菌性急性腸胃炎的病毒，如諾病毒感染性強，以腸道傳播為主， 通過口-糞傳播，以污染的水源、食物、貝類、物品、空氣作為主要傳播載體。諾如病毒可分為 G I-G 五個基因群，其中引起人類感染的主要是 G1 和 G2 群。因此快速靈敏診斷具有重要意義。本產(chǎn)品以探針法熒光定量 RT-PCR 技術(shù)為基礎(chǔ)開發(fā)的專門檢測諾如病毒 G1 型的試劑盒，它具有下列特點：
1.即開即用，用戶只需要提供樣品 RNA 模板。
2.引物和探針經(jīng)過優(yōu)化，靈敏性高。
3.提供陽性對照，便于區(qū)分假陰性樣品。
4.特異性高，引物是根據(jù)諾如病毒 G1 型高度保守區(qū)設(shè)計，不會跟其他病毒的RNA 發(fā)生交叉反應。
5.本產(chǎn)品足夠 50 次 20μL 體系的探針法熒光定量 RT-PCR 反應。
6.本產(chǎn)品只能用于科研。
規(guī)格及成分
| 成分 | 十孔盒包裝 |
| 探針法 qRT-PCR 緩沖液 | 500μL（藍蓋） |
| 探針法 qRT-PCR 酶混合液 | 100μL（紅蓋） |
| 熒光PCR 專用模板稀釋液 | 1 mL（黃蓋） |
諾如病毒 G1 型探針法 qRT-PCR 引物混合液 | 100 μL（白蓋） |
| 諾如病毒 G1 型 qRT-PCR 探針 | 50 μL（棕色管） |
諾如病毒 G1 型探針法 qRT-PCR 陽性對照(1×10E8 拷貝/μL) | 50 μL（黃蓋） |
| 使用手冊 | 1 份 |
諾如病毒G1型探針法熒光定量RT-PCR試劑盒運輸及保存
低溫運輸，-20℃保存，保存期限為12個月。
自備試劑樣品：RNA
使用方法
一、稀釋標準曲線樣品（以 10E2-10E7 拷貝/μL 這 6 個 10 倍稀釋度為例）。由于標準品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨立的區(qū)域進行，千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分）。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴散傳染性病原， 本產(chǎn)品不提供活體樣品做陽性對照，只提供無傳染性的 DNA 片段作為陽性對照。
1. 標記 6 個離心管，分別為 7，6，5，4，3，2。
2.用帶芯槍頭分別加入 45 μL 熒光 RT-PCR 專用模板稀釋液，最好用帶芯槍頭，下同）。
3.在 7 號管中加入 5 μL 1×10E8 拷貝/μL 的陽性對照(試劑盒提供)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E7 拷貝/μL 的標準曲線樣品。放冰上待用。
4.換槍頭，在 6 號管中加入 5 μL 1×10E7 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E6 拷貝/μL 的標準曲線樣品。放冰上待用。
5.換槍頭，在 5 號管中加入 5 μL 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E5 拷貝/μL 的標準曲線樣品。放冰上待用。
6.重復上面的操作直到得到 6 個稀釋度的標準曲線樣品。放冰上待用。
二、樣品 RNA 的制備
7.如果有 N 個樣品，最好設(shè)置 N+2 個提取，多出的一個是 PC（樣品制備陽
性對照），一個是 NC（樣品制備陰性對照）?？梢杂?0μL 陽性對照的10000倍稀釋液再加上一定量的水使總體積跟每次制備要求的體積一樣， 以此作為PC。另外用水作為 NC。
8.用自選方法純化樣品的 RNA，本試劑盒跟市場上大多數(shù)病毒 RNA 提取試劑盒兼容。也可以選購本公司的柱式病毒 RNAout。
9.如果做定量分析并且只做 1 次重復，則標記 N+9 個 PCR 管，其中 N+2 個用于上步得到的 N+2 個樣品，1 個用于 PCR 陰性對照（用水做模板），6 個用于標準曲線。如果做定性分析，并且只做 1 次重復，則標記 N+4 個PCR 管，其中 N+2 個用于上步得到的 N+2 個樣品，1 個用于 PCR 陰性對照（用水做模板），1 個用于 PCR 陽性對照（用第 4 號管的陽性對照稀釋液做模板）。下面只以定量分析為例描述操作步驟。
10.在標記管中按下表加入各成分（本表只列出一次重復。樣品管和陰性對照設(shè)置完畢后才設(shè)置陽性對照，并且陽性對照樣品要等所有管子蓋上蓋子儲存好
后最后加）：
| 成分 | 樣品管 N+2 個 | RT-PCR 陰性對照管 | 標準曲線樣品管 （2-7 管） |
| 探針法 qRT-PCR 緩沖液 | 各 10 μL | 10 μL | 各 10 μL |
| 探針法 qRT-PCR 酶混合液 | 各 2 μL | 2 μL | 各 2 μL |
| 諾如病毒 G1 型 qRT-PCR 探針 | 各 1 μL | 1 μL | 各 1 μL |
諾如病毒 G1 型探針法 qRT-PCR 引物混合液 | 各 2 μL | 2 μL | 各 2 μL |
| 待測樣品 RNA 模板 | 各 5 μL | - | - |
| 超純水 | - | 5 μL | - |
第 7 步所得標準曲線樣品稀釋液 （2-7 號） | - | - | 各 5 μL（2號樣到 2 號管，3 號樣到3 號管…） |
11.蓋上蓋子后上機，按下面參數(shù)進行 qRT-PCR：
| 過程 | 溫度 | 時間 |
| 逆轉(zhuǎn)錄 | 50℃ | 30min |
| 預變性 | 94℃ | 10min |
qRT-PCR反應 （40個循環(huán)） | 94℃ | 15sec |
| 60℃ | 1min（采集FAM通道的熒光信號） |
12.如果把本試劑盒用于定量檢測，則以陽性對照濃度的 log 值為橫軸，以 Ct 值為縱軸，繪制標準曲線。再以待測樣品的 Ct 值從標準曲線上推算出樣品 RNA 濃度的 log 值，再推算出其濃度。
13.如果把本試劑盒用于定性檢測，只判斷陽性或陰性，則陰性對照 Ct 必須大于或等于 40。陽性對照必須有熒光對數(shù)增長，有典型擴增曲線，Ct 值應該小于或等于 30。對待測樣品，如果其 Ct 大于或等于 40 則為陰性，如果小于或等于 35 則為陽性。如果在 35-40 之間，則重復一次。重復實驗的 Ct 值如果大于或等于 40 則為陰性，如果小于 35，則為陽性。
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