【產(chǎn)品名稱】

商品名稱：豬圓環(huán)病毒通用型 （PCV-U）核酸檢測試劑盒（熒光 PCR 法）

Name：Porcine Circovirus Detection Kit （Real-Time PCR Method）

【包裝規(guī)格】50T/盒

【預期用途】

豬圓環(huán)病是由豬圓環(huán)病毒（Porcine Circovirus）引起豬的一種傳染性、先天性顫抖和斷奶仔豬多系統(tǒng)功能障礙性疾病。該病毒具有 PCV1 和 PCV2 兩種血清型，PCV1 無致病性。受 PCV2 感染的斷奶仔豬出現(xiàn)呼吸急促、困難、腹瀉、貧血、明顯的淋巴組織病變及進行性消瘦。

本試劑盒適用于檢測肺、淋巴結(jié)組織、全血等樣本中的豬圓環(huán)病毒通用型，用于豬圓環(huán)病毒通用型感染的輔   助診斷。

【檢驗原理】

本試劑盒對豬圓環(huán)病毒基因保守區(qū)設計特異性引物和探針，用熒光 PCR 技術對豬圓環(huán)病毒通用型的 DNA 進行體外擴增檢測，用于科研上對可疑感染者的病原學檢測。

【試劑組成】

包裝規(guī)格50T/盒

PCV-U 反應液500μL×2 管

酶液50μL×1 管

PCV-U 陽性質(zhì)控品 1.49×10^8拷貝/mL50μL ×1 管

陰性質(zhì)控品250μL ×1 管

說明：不同批號的試劑盒組分不可交互使用

【儲存條件及有效期】

-20℃±5℃避光保存，有效期 12 個月。避免反復凍融，凍融次數(shù)不超過 5 次；生產(chǎn)日期和失效日期見標簽。

【適用儀器】

ABI7500、安捷倫 MX3000P/3005P、LightCycler、Bio-Rad、Eppendorf 等系列熒光定量 PCR 檢測儀。

【標本采集】

組織樣品采集：采取病死豬（包括流產(chǎn)的死胎）)或撲殺豬主要臟器（淋巴結(jié)、脾臟、肺臟、腎臟和肝臟） 裝入滅菌 15 mL 離心管中，編號，送實驗室。血清樣品采集：用無菌注射器抽取受檢豬靜脈血不少于 5 ml，置于無菌離心管內(nèi)，室溫或者 37℃傾斜放置自然凝集 20 min ~30 min，2 000 r/min~3 000 r/min 離心 10 min，吸取上清液到新的離心管內(nèi)備用。精液樣品采集：按照 GB/T 25172 的方法采集和保存精液。糞便樣品采集：取豬新鮮糞便 1 g，裝入 15 mI 滅菌離心管中，加入 5 mL PBS，混勻。細胞培養(yǎng)物：細胞培養(yǎng)物反復凍融 3 次，第 3 次解凍后，將細胞培養(yǎng)物置于 1.5 mL 無 DNA 酶的滅菌離心管內(nèi)，編號備用。

【保存和運輸】

采集或處理好的樣品在 2℃~8℃條件下保存應不超過 24 h；若需長期保存，應放置-70℃以下保存，凍融不超過 3 次。

【使用方法】

1.樣品處理（樣本處理區(qū)）

1.1樣本前處理

組織樣品：取 1 g 解凍的組織，剪碎，加入 2 mL PBS 進行研磨，制備組織勻漿，8000 r/min 離心 5 min，取上清用于后續(xù)的核酸提取。血清和精液樣品無需進行前處理，直接用于核酸提取。糞便樣品：3000 r/min 離心 10 min，取上清液，轉(zhuǎn)入 1.5 mL 離心管中，用于后續(xù)的核酸提取。細胞培養(yǎng)物：4000 r/min，4℃離心 l0 min，取上清用于后續(xù)的核酸提取。

1.2核酸提取

推薦采用優(yōu)利科（上海）生命科學有限公司生產(chǎn)的核酸提取試劑（離心柱法）進行核酸提取，請按照試劑說明    書進行操作。

2.試劑配制（試劑準備區(qū)）

根據(jù)待檢測樣本總數(shù)，設所需要的 PCR 反應管管數(shù)為 N（N=樣本數(shù)+1 管陰性對照+1 管陽性對照；反應管數(shù)每滿 10 份，多配制 1 份），每測試反應體系配制如下表：

試劑PCV-U 反應液酶液

用量（樣本數(shù)為 N）19μL1μL

將混合好的測試反應液分裝到 PCR 反應管中，20μL 管。

3.加樣（樣本處理區(qū)）

將步驟 1 提取的核酸、陽性質(zhì)控品、陰性質(zhì)控品各取 5μL，分別加入相應的反應管中，蓋好管蓋，混勻，短暫離心。

4.PCR 擴增（核酸擴增區(qū)）

4.1將待檢測反應管置于熒光定量 PCR 儀反應槽內(nèi)；

4.2設置好通道、樣品信息，反應體系設置為 25μL；

熒光通道選擇：檢測通道（Reporter Dye）FAM， 淬滅通道（Quencher Dye）NONE，ABI 系列儀器請勿選擇 ROX

參比熒光，選擇 None 即可。

4.3推薦循環(huán)參數(shù)設置：

步驟循環(huán)數(shù)溫度時間收集熒光信號

11 cycle95℃2min否

245 cycles95℃15sec否

60℃30sec是

5.結(jié)果分析判定

5.1結(jié)果分析條件設定（請參照各儀器使用說明書進行設置，以分析 ABI7500 儀器為例）

反應結(jié)束后自動保存結(jié)果，根據(jù)分析后圖像調(diào)節(jié) Baseline 的 Start 值、End 值以及 Threshold 值（用戶可根據(jù)實際情況自行調(diào)整，Start 值可設在 3～15、End 值可設在 5～20，使閾值線位于擴增曲線指數(shù)器，陰性質(zhì)控品的擴增曲線平直或低于閾值線），點擊 Analyze 自動獲得分析結(jié)果。

5.2結(jié)果判斷

陽性：檢測通道 Ct 值≤40，且曲線有明顯的指數(shù)增長曲線； 陰性：樣本檢測結(jié)果 Ct 值>40 或無 Ct 值。

5.3質(zhì)控標準

陰性質(zhì)控品：無特異性擴增曲線或無 Ct 值顯示；

陽性質(zhì)控品：擴增曲線有明顯指數(shù)增長期，且 Ct 值≤32； 以上條件應同時滿足，否則實驗視為無效。

6.檢測方法的局限性

1.樣本檢測結(jié)果與樣本收集、處理、運送以及保存質(zhì)量有關；

2.樣本提取過程中沒有控制好交叉污染，會出現(xiàn)假陽性結(jié)果；

3.陽性對照、擴增產(chǎn)物泄漏，會導致假陽性結(jié)果；

4.病原體在流行過程中基因突變、重組，會導致假陰性結(jié)果；

5.不同的提取方法存在提取效率差異，會導致假陰性結(jié)果；

6.試劑運輸，保存不當或試劑配制不準確引起的試劑檢測效能下降，出現(xiàn)假陰性或定量檢測不準確的結(jié)果；

7.本檢測結(jié)果僅供參考，如須確診請結(jié)合臨床癥狀以及其他檢測手段。

【注意事項】

1.所有操作嚴格按照說明書進行；

2.試劑盒內(nèi)各種組分使用前應自然融化，完-全混勻并短暫離心；

3.反應液應避光保存；

4.反應中盡量避免氣泡存在，管蓋需蓋緊；

5.使用一次性吸頭、一次性手套和各區(qū)專用工作服；

6.樣本處理、試劑配制、加樣需在不同區(qū)進行，以免交叉污染；

7.實驗完畢后用 10%次氯酸或 75%酒精或紫外燈處理工作臺和移液器；

8.試劑盒里所有物品應視為污染物對待，并按照《微生物生物醫(yī)學實驗室生物安全通則》進行處理。

【參考文獻】

[1] 國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局. GB/T 35901-2018  豬圓環(huán)病毒 2 型熒光 PCR 檢測方法[S].