單寧含量試劑盒說(shuō)明書(shū)

                                 微量法100管/96樣

注   意 ：正式測(cè)定前取2-3個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定

測(cè)定意義：

單寧是一類(lèi)廣泛存在于植物體內(nèi)的多元酚化合物，又稱(chēng)植物多酚。具有du特的化學(xué)性質(zhì)和多種生理活性，如能與蛋白質(zhì)、生物堿、多糖結(jié)合；能與多種金屬離子發(fā)生絡(luò)合或靜電作用；具有止血、抑制微生物、抗過(guò)敏、抗突變、抗腫瘤、抗衰老等生理活性。

測(cè)定原理：

單寧在堿性環(huán)境下與磷鉬酸反應(yīng)，生成藍(lán)色化合物，在760nm處有最大吸收峰。

需自備的儀器和用品：

可見(jiàn)分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、水浴鍋、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研缽和蒸餾水。

試劑的組成和配制：

試劑一：液體4mL× 1瓶，4℃保存；

試劑二：液體3mL × 1瓶，4℃保存；

單寧的提取：

按照組織質(zhì)量（g）：蒸餾水體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱(chēng)取約0.1g組織，加入1mL蒸餾水），充分勻漿后轉(zhuǎn)移到EP管中，80℃水浴提取30min， 8000 g，25℃離心10 min，取上清液待測(cè)。

測(cè)定步驟：

1、分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至760nm處，蒸餾水調(diào)零；試劑一和試劑二37℃預(yù)熱10min以上；

2、操作表：

混勻，室溫靜置5min

混勻，室溫靜置30min，760nm處讀取吸光值A，ΔA=A測(cè)定-A對(duì)照，對(duì)照管只要做一管。

單寧含量計(jì)算：

a.用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下：

1、標(biāo)準(zhǔn)條件下測(cè)定的回歸方程為y = 1.6418x +0.0134；x為標(biāo)準(zhǔn)品濃度(mg/mL)，y為ΔA(A測(cè)定-A對(duì)照)。

2、按樣本鮮重計(jì)算：

單寧含量（mg /g鮮重）= [(ΔA-0.0134) ÷1.6418×V1]÷（W×V1÷V2）=0.609×(ΔA-0.0134) ÷W。

3、按樣本蛋白濃度計(jì)算：

單寧含量(mg/mg prot)= [(ΔA-0.0134) ÷1.6418×V1]÷(V1×Cpr)=0.609×(ΔA-0.0134) ÷Cpr。

V1：加入樣本體積，0.005mL；V2：加入提取液體積，1mL； Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本鮮重，g。

b.用96孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下：

1、標(biāo)準(zhǔn)條件下測(cè)定的回歸方程為y = 0.8209x+0.0134；x為標(biāo)準(zhǔn)品濃度（mg/mL），y為ΔA(A測(cè)定-A對(duì)照)。

2、按樣本鮮重計(jì)算：

單寧含量(mg/g鮮重)=[(ΔA-0.0134)÷0.8209×V1]÷(W×V1÷V2)=1.218×(ΔA-0.0134) ÷W。

3、按樣本蛋白濃度計(jì)算：

單寧含量(mg/mg prot)= [(ΔA-0.0134)÷0.8209×V1]÷(V1×Cpr)=1.218×(ΔA-0.0134)÷Cpr。

V1：加入樣本體積，0.005mL；V2：加入提取液體積，1mL； Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本鮮重，g。

注意：

1、   ΔA控制在0.02-0.5范圍內(nèi)，若ΔA大于0.5，將樣本提取上清液用蒸餾水稀釋10倍后檢測(cè)，計(jì)算公式中乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù)。

2、   標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍為：0.025mg/mL-0.5mg/mL。