單脫氫抗壞血酸還原酶（MDHAR）活性測(cè)定試劑盒說(shuō)明書

                                                   微量法100T/96S

注    意：正式測(cè)定之前選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測(cè)定。

測(cè)定意義：

MDHAR催化MDHA還原生成AsA，在抗壞血酸氧化還原代謝中具有重要作用。

測(cè)定原理：

MDHAR 催化 NADH 還原MDHA 生成 AsA和NAD⁺，NADH在340 nm有特征吸收峰，但是NAD⁺沒(méi)有。通過(guò)測(cè)定340 nm光吸收下降速率，來(lái)計(jì)算出MDHAR活性。

實(shí)驗(yàn)中所需儀器及設(shè)備：

研缽、冰、臺(tái)式離心機(jī)、紫外分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、微量石英比色皿/96孔板、可調(diào)式移液槍和雙蒸水

試劑組成和配置：

試劑一：液體100mL×1瓶，4℃保存。

試劑二：液體20mL×1瓶，室溫保存。

試劑三：粉劑×1瓶（棕色），4℃保存。臨用前加入3 mL蒸餾水充分溶解。

試劑四：粉劑×1瓶，4℃保存。臨用前加入2.5 mL蒸餾水充分溶解。

試劑五：液體15μL×1瓶，4℃保存。臨用前加3 mL試劑二充分溶解。

粗酶液提取：

1.        組織：按照組織質(zhì)量（g）：試劑一體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL試劑一）進(jìn)行冰浴勻漿。8000g，4℃離心10min，取上清置冰上待測(cè)。

2.        . 細(xì)菌、真菌：按照細(xì)胞數(shù)量（10⁴個(gè)）：試劑一體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬(wàn)細(xì)胞加入1mL試劑一），冰浴超聲波破碎細(xì)胞（功率300w，超聲3秒，間隔7秒，總時(shí)間3min）；8000g ，4℃離心20min，取上清液置冰上混勻待測(cè)。

3.  血清等液體：直接測(cè)定。

MDHAR測(cè)定操作：

1. 分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀預(yù)熱30 min，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)到340 nm，蒸餾水調(diào)零。

2. 試劑二在25℃水浴鍋中預(yù)熱30 min。

3.依次在微量石英比色皿/96孔板中加入20μL試劑三、20μL試劑四、20μL試劑五和120μL試劑二，最后加入20μL上清液，迅速混勻后于340nm比色，記錄30s和150s的吸光值30s和150s的吸光值A1和A2，△A=A1-A2。

MDHAR活性計(jì)算公式：

a.使用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下

(1). 按蛋白濃度計(jì)算

MDHAR活性單位定義：25℃中每毫克蛋白每分鐘氧化1nmol NADH 為1個(gè)酶活單位。

MDHAR (nmol/min /mg prot) = △A÷ε÷d×V反總×10⁹]÷（Cpr×V樣）÷T

= 804×△A ÷Cpr

(2). 按樣本質(zhì)量計(jì)算

MDHAR活性單位定義：25℃中每克樣本每分鐘氧化1nmol NADH 為1U。

MDHAR (nmol/min /g 鮮重) = △A÷ε÷d×V反總×10⁹]÷（W×V樣÷V樣總）÷T

= 804×△A ÷W

（3）按細(xì)胞數(shù)量計(jì)算

MDHAR活性單位定義：25℃中每10⁴個(gè)細(xì)胞每分鐘氧化1nmol NADH 為1個(gè)酶活單位。

MDHAR (nmol/min/10⁴ cell) = △A÷ε÷d×V反總×10⁹÷（細(xì)胞數(shù)量×V樣÷V樣總）÷T

= 804×△A ÷ 細(xì)胞數(shù)量

（4）按液體體積計(jì)算

MDHAR活性單位定義：25℃中每毫升液體每分鐘氧化1nmol NADH 為1個(gè)酶活單位。

MDHAR (nmol/min /mL) = △A÷ε÷d×V反總×10⁹÷V樣）÷T

= 804×△A

ε：NADH摩爾消光系數(shù)，6220 L/mol/cm；d：比色皿光徑，1cm；V反總：反應(yīng)體系總體積，0.2mL=2×10^-4L；V樣：加入反應(yīng)體系中上清液體積，20μL=0.02mL；V樣總：提取液體積，1 mL；Cpr：上清液蛋白濃度，mg/mL，蛋白質(zhì)濃度需要另外測(cè)定，建議使用本公司蛋白質(zhì)含量BCA試劑盒；W ：樣品質(zhì)量；T：反應(yīng)時(shí)間，2min。

b.使用96孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下：

(1). 按蛋白濃度計(jì)算

MDHAR活性單位定義：25℃中每毫克蛋白每分鐘氧化1nmol NADH 為1個(gè)酶活單位。

MDHAR (nmol/min /mg prot) = △A÷ε÷d×V反總×10⁹]÷（Cpr×V樣）÷T

= 1608×△A ÷Cpr

(2). 按樣本質(zhì)量計(jì)算

MDHAR活性單位定義：25℃中每克樣本每分鐘氧化1nmol NADH 為1U。

MDHAR (nmol/min /g 鮮重) = △A÷ε÷d×V反總×10⁹]÷（W×V樣÷V樣總）÷T

= 1608×△A ÷W

（3）按細(xì)胞數(shù)量計(jì)算

MDHAR活性單位定義：25℃中每10⁴個(gè)細(xì)胞每分鐘氧化1nmol NADH 為1個(gè)酶活單位。

MDHAR (nmol/min/10⁴ cell) = △A÷ε÷d×V反總×10⁹÷（細(xì)胞數(shù)量×V樣÷V樣總）÷T

= 1608×△A ÷ 細(xì)胞數(shù)量

（4）按液體體積計(jì)算

MDHAR活性單位定義：25℃中每毫升液體每分鐘氧化1nmol NADH 為1個(gè)酶活單位。

MDHAR (nmol/min /mL) = △A÷ε÷d×V反總×10⁹÷V樣）÷T

=1608×△A

ε：NADH摩爾消光系數(shù)，6220 L/mol/cm；d：96孔板光徑，0.5cm；V反總：反應(yīng)體系總體積，0.2mL=2×10^-4L；V樣：加入反應(yīng)體系中上清液體積，20μL=0.02mL；V樣總：提取液體積，1 mL；Cpr：上清液蛋白濃度，mg/mL，蛋白質(zhì)濃度需要另外測(cè)定，建議使用本公司蛋白質(zhì)含量BCA試劑盒；W ：樣品質(zhì)量；T：反應(yīng)時(shí)間，2min。

注意事項(xiàng)：

臨用前配制的試劑未使用完的4℃保存，3天內(nèi)使用完。