磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PEPC)試劑盒說明書

                                          微量法100管/96樣

注    意：正式測定前務必取2-3個預期差異較大的樣本做預測定

測定意義：

PEPC（EC 4.1.1.31）廣泛存在于動物、植物、微生物和細胞中，是催化磷酸烯醇式丙酮酸與二氧化碳反應生成草酰乙酸呈不可逆反應的酶，對三羧酸循環(huán)的運轉(zhuǎn)起重要調(diào)節(jié)作用。

測定原理：

PEPC催化磷酸烯醇式丙酮酸和CO₂生成草酰乙酸和HPO4^2-，蘋果酸脫氫酶進一步催化草酰乙酸和NADH生成蘋果酸和NAD⁺，在340nm測定NADH減少速率，計算PEPC活性。

需自備的儀器和用品：

紫外分光光度計/酶標儀、臺式離心機、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研缽、冰和蒸餾水。

試劑的組成和配制：

提取液：100mL×1瓶，4℃保存；

試劑一：液體15 mL×1瓶， 4℃保存；

試劑二：粉劑×2瓶，-20℃保存；

試劑三 ：原液10μL×1支，4℃保存；

試劑三：稀釋液5mL×1瓶，4℃保存；

樣本的前處理：

1、細菌或培養(yǎng)細胞：先收集細菌或細胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細菌或細胞數(shù)量（10⁴個）：提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細菌或細胞加入1mL提取液），超聲波破碎細菌或細胞（冰浴，功率20％或200W，超聲3s，間隔10s，重復30次）；8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。

2、組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液），進行冰浴勻漿。8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。

3、血清（漿）樣品：直接檢測。

測定步驟和加樣表：

1、   分光光度計或酶標儀預熱30min以上，調(diào)節(jié)波長至340nm，蒸餾水調(diào)零。

2、   樣本測定

（1）取試劑二瓶一瓶，加入6mL試劑一和4.2mL蒸餾水充分混勻，置于37℃（哺乳動物）或25℃（其它物種）水浴5min；現(xiàn)配現(xiàn)用。

（2）試劑三工作液的配制：將試劑三原液：試劑三稀釋液=1μL:329μL稀釋，混勻，用多少配多少。

（3）在微量石英比色皿或96孔板中加入10μL樣本、20μL試劑三、170μL試劑二，混勻，立即記錄340nm處20s時的吸光值A1和5min20s后的吸光值A2，計算ΔA=A1-A2。

PEPC活性計算：

a. 用微量石英比色皿測定的計算公式如下

1、血清（漿）PEPC活力計算

單位定義：每毫升血清（漿）每分鐘消耗1 nmol NADH定義為一個酶活力單位。

PEPC（nmol/min/mL）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷V樣÷T=643×ΔA

2、組織、細菌或細胞中PEPC活力計算

（1）按樣本蛋白濃度計算

單位定義：每mg組織蛋白每分鐘消耗1nmol NADH定義為一個酶活力單位。

PEPC（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(V樣×Cpr) ÷T=643×ΔA÷Cpr

（2）按樣本鮮重計算

單位定義：每g組織每分鐘消耗1 nmol NADH定義為一個酶活力單位。

PEPC（nmol/min/g 鮮重）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(W ×V樣÷V樣總)÷T=643×ΔA÷W

（3）按細菌或細胞密度計算：

單位定義：每1萬個細胞每分鐘消耗1 nmol NADH定義為一個酶活力單位。

PEPC（nmol/min/10⁴ cell）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(500×V樣÷V樣總)÷T=1.286×ΔA

V反總：反應體系總體積，2×10^-4 L；ε：NADH摩爾消光系數(shù)，6.22×10³ L / mol /cm；d：比色皿光徑，1cm；V樣：加入樣本體積，0.01 mL；V樣總：加入提取液體積，1 mL；T：反應時間，5 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；500：細菌或細胞總數(shù)，500萬。

b. 用96孔板測定的計算公式如下

1、血清（漿）PEPC活力計算

單位定義：每毫升血清（漿）每分鐘消耗1 nmol NADH定義為一個酶活力單位。

PEPC（nmol/min/mL）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷V樣÷T=1286×ΔA

2、組織、細菌或細胞中PEPC活力計算

（1）按樣本蛋白濃度計算

單位定義：每mg組織蛋白每分鐘消耗1nmol NADH定義為一個酶活力單位。

PEPC（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(V樣×Cpr) ÷T=1286×ΔA÷Cpr

（2）按樣本鮮重計算

單位定義：每g組織每分鐘消耗1 nmol NADH定義為一個酶活力單位。

PEPC（nmol/min/g 鮮重）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(W× V樣÷V樣總)÷T=1286×ΔA÷W

（3）按細菌或細胞密度計算：

單位定義：每1萬個細胞每分鐘消耗1 nmol NADH定義為一個酶活力單位。

PEPC（nmol/min/10⁴ cell）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(500×V樣÷V樣總)÷T=2.572×ΔA

V反總：反應體系總體積，2×10^-4 L；ε：NADH摩爾消光系數(shù)，6.22×10³ L / mol /cm；d：96孔板光徑，0.5cm；V樣：加入樣本體積，0.01 mL；V樣總：加入提取液體積，1 mL；T：反應時間，5 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；500：細菌或細胞總數(shù)，500萬。