亞鐵氧化酶（Hephaestin,HP）試劑盒說明書

                                        微量法100管/48樣

注   意 ：正式測定前務必取2-3個預期差異較大的樣本做預測定

測定意義：

Hephaestin (HP)作為銅藍蛋白的同系物,是近年來發(fā)現(xiàn)的鐵轉運蛋白亞鐵氧化酶，HP屬亞鐵氧化酶家族成員,具有亞鐵氧化酶的活性,參與體內鐵代謝。HP的表達可受鐵、銅及鋅等金屬離子的調節(jié)。HP催化Fe²⁺氧化生成Fe³⁺，在介導鐵的跨膜轉運中有重要作用。

測定原理：

HP催化Fe²⁺氧化為Fe³⁺，Fe²⁺和ferrozine反應顯色，在560 nm下有特征吸光值。通過測定Fe²⁺的減少速率可測得亞鐵氧化酶的活性。

自備用品：

酶標儀、臺式離心機、可調式移液器、96孔板、研缽、冰和蒸餾水。

試劑組成和配制：

試劑一：液體60 mL×1瓶，4℃保存;

試劑二：液體1.5 mL×1瓶，4℃保存;

試劑三：液體11 mL×1瓶，4℃避光保存。

粗酶液提取：

按照組織質量（g）：水（mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL蒸餾水），進行冰浴勻漿。10000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。

測定步驟：

1. 酶標儀預熱30 min以上，調節(jié)波長至560 nm。

2. 在96孔板中加入下列試劑

HP活性計算:

標準曲線：y = 8.2135x - 0.0006，R² = 0.9998；(x為標準品濃度，μmol/mL；y為吸光值ΔA)

（1）按樣本質量計算

單位定義：每g樣本每分鐘氧化1nmol Fe²⁺定義為一個酶活力單位。

HP（nmol/min/g 鮮重）=（△A+0.0006）÷ 8.2135×V總÷T ÷(W× V樣÷V樣總)× 1000

                       = 40.58×（△A+0.0006）÷W

（2）按樣本蛋白濃度計算

單位定義：每mg蛋白每分鐘氧化1nmol Fe²⁺定義為一個酶活力單位。

HP（nmol/min/mg prot）=（△A+0.0006）÷ 8.2135×V總÷T ÷（Cpr×V樣）

                       = 40.58×（△A+0.0006）÷Cpr

V總：反應體系體積，0.1 mL；V樣：加入樣本體積0.01 mL；V樣總：加入提取液體積，1 mL；T：反應時間，30min；W：樣品質量，g；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/mL；1000，μmol到nmol的轉換系數(shù)。