木質(zhì)素過(guò)氧化物酶（Lignin peroxidase，Lip）試劑盒說(shuō)明書

         微量法100T/96S

注   意 ：正式測(cè)定之前選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測(cè)定。

測(cè)定意義：

木質(zhì)素過(guò)氧化物酶（EC1.11.1.14）是一種含亞鐵血紅素的過(guò)氧化物酶，屬于木質(zhì)素降解酶系，在木質(zhì)素生物降解、造紙工業(yè)、紡織工業(yè)、芳香化合物轉(zhuǎn)化與降解及環(huán)境污染控制等方面具有較大的應(yīng)用潛力。

測(cè)定原理：

木質(zhì)素過(guò)氧化物酶催化天青脫甲基，在651nm處測(cè)定吸光值減少。

自備實(shí)驗(yàn)用品及儀器：

天平、研缽、低溫離心機(jī)、酶標(biāo)儀、96孔板、可調(diào)式移液器、冰。

試劑組成和配制： 

試劑一：粉劑×1瓶，4℃保存。臨用前加入115mL蒸餾水，充分溶解待用，用不完的試劑4℃保存一個(gè)月。

試劑二：液體5mL×1瓶，4℃避光保存。

試劑三：液體5mL×1支，4℃保存。

酶液提取：

1.        組織：按照質(zhì)量（g）：試劑一體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g，加入1mL試劑一）加入試劑一，冰浴勻漿后于4℃，10000g離心10min，取上清置于冰上待測(cè)。

2.        細(xì)胞：按照細(xì)胞數(shù)量（104個(gè)）：試劑一體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬(wàn)細(xì)胞加入1mL試劑一），冰浴超聲波破碎細(xì)胞（功率300w，超聲3秒，間隔7秒，總時(shí)間3min）；然后4℃，10000g離心10min，取上清置于冰上待測(cè)。

3.        培養(yǎng)液或其它液體：直接檢測(cè)。                        

測(cè)定操作：

1、酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至651nm。

2、臨用前按每個(gè)樣本試劑一：試劑二：試劑三=80:40:40（μL）的比例配制工作液，現(xiàn)配現(xiàn)用。

3、在96孔板中依次加入如下試劑

酶活計(jì)算公式：

1．按照蛋白濃度計(jì)算

酶活性定義：每mg組織蛋白在每mL反應(yīng)體系中每分鐘A651變化0.01為一個(gè)酶活力單位。

LiP活性（U/mg prot）= ΔA×V反總÷（V樣×Cpr）÷0.01÷T =250×ΔA÷Cpr

2．按照樣本質(zhì)量計(jì)算

酶活性定義：每g組織在每mL反應(yīng)體系中每分鐘A651變化0.01為一個(gè)酶活力單位。

LiP活性（U/g 鮮重）=ΔA×V反總÷(W× V樣÷V樣總)÷0.01÷T =250×ΔA÷W

3．按照細(xì)胞數(shù)量計(jì)算

酶活性定義：每1萬(wàn)個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞在每mL反應(yīng)體系中每分鐘A651變化0.01為一個(gè)酶活力單位。

LiP活性（U/104 cell）=ΔA×V反總÷(500×V樣÷V樣總)÷0.01÷T=0.5×ΔA

4．按照液體體積計(jì)算

酶活性定義：每mL血清（漿）在每mL反應(yīng)體系中每分鐘A651變化0.01為一個(gè)酶活力單位。

LiP活性（U/mL）=ΔA×V反總÷V樣÷0.01÷T =250×ΔA

V反總：反應(yīng)總體積，0.2mL；V樣：反應(yīng)中樣本體積，0.04mL；V樣總：加入提取液體積，1mL；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；T：反應(yīng)時(shí)間，2min