牛病毒性腹瀉病毒（BVDV）核酸檢測試劑盒（熒光 PCR 法）

【產(chǎn)品名稱】

商品名稱：牛病毒性腹瀉病毒（BVDV）核酸檢測試劑盒（熒光 PCR 法）

Name：  Bovine Viral Diarrhea Virus Detection Kit (Real-Time PCR Method)

【包裝規(guī)格】50T/盒

【預(yù)期用途】

本試劑盒適用于檢測的牛的組織樣品、鼻拭子等標(biāo)本中牛病毒性腹瀉病毒核酸，適用于牛病毒性腹瀉病毒   感染的輔助診斷。

【檢驗原理】

本試劑盒采用 TaqMan 探針法實時熒光 PCR 技術(shù)，設(shè)計一對牛病毒性腹瀉病毒特異性引物，結(jié)合一條特異性探針，用熒光 PCR 技術(shù)對牛病毒性腹瀉病毒的核酸進(jìn)行體外擴(kuò)增檢測，用于臨床上對可疑感染病料的病原學(xué)診斷。

【試劑組成】

說明：不同批號的試劑盒組分不可交互使用。

【儲存條件及有效期】

-20℃±5℃，避光保存、運輸、反復(fù)凍融次數(shù)不超過 5 次，有效期 12 個月。

【適用儀器】

ABI7500、安捷倫 MX3000P/3005P、LightCycler、Bio-Rad、Eppendorf 等系列熒光定量 PCR 檢測儀。

【標(biāo)本采集】

組織樣品：用無菌剪刀、鑷子采集待檢臟器或組織。可采集腸粘膜刮取物或肺、脾、淋巴結(jié)等作為待檢組織樣品；對流產(chǎn)胎牛、死胎，直接采集胎兒的組織；對懷疑死于粘膜病的牛，可采集xue塊或肺、脾、淋巴結(jié)等組織，尤其是腸道集合淋巴組織，如腸道樣品已發(fā)生自溶，可采扁桃體和淋巴結(jié)。將采集的樣品裝入無菌采樣袋或其他滅菌容器，編號備用；鼻拭子：對疑似為急性感染期或持續(xù)感染的牛，采集鼻分泌物拭子。取鼻拭子時將拭子深入鼻腔來回擦拭 2 次~3 次并旋轉(zhuǎn)，取分泌物；將采樣后的拭子放入盛有 2.0 mL PBS 的采樣管中，編號備用。

其它樣本采集請參考 GB/T 18637-2018 《牛病毒性腹瀉/粘膜病診斷技術(shù)規(guī)范》。

【保存和運輸】

采集或處理好的樣品在 2℃~8℃條件下保存應(yīng)不超過 24 h；若需長期保存，應(yīng)放置-70℃以下保存，凍融不超過 3 次。

【使用方法】

1.  樣品處理（樣本處理區(qū)）

1.1  樣本前處理

組織樣品：用無菌的剪刀和鑷子剪取待檢樣品 2.0g 于研缽或組織勻漿器中充分研磨，再加 10.0mLPBS 混勻，

2000r/min 離心 5 min 后，取 1.0ml 上清液轉(zhuǎn)入無菌 1.5mL 滅菌離心管中，編號備用。

鼻拭子：用含 1000U/mL 青霉素和鏈霉素的細(xì)胞培養(yǎng)液 4 倍稀釋后，2000r/min 離心 15min 取上清液，編號備用。

其他樣本前處理請參考 GB/T 18637-2018 《牛病毒性腹瀉/粘膜病診斷技術(shù)規(guī)范》。

1.2  核酸提取

推薦采用優(yōu)利科（上海）生命科學(xué)有限公司生產(chǎn)的核酸提取或純化試劑（磁珠法或離心柱法）進(jìn)行核酸提取，請按    照試劑說明書進(jìn)行操作。

2.  試劑配制（試劑準(zhǔn)備區(qū)）

根據(jù)待檢測樣本總數(shù)，設(shè)所需要的 PCR 反應(yīng)管管數(shù)為 N(N=樣本數(shù)+1 管陰性對照+1 管陽性對照；樣品每滿

10 份，多配制 1 份)，每測試反應(yīng)體系配制如下表：

將混合好的測試反應(yīng)液分裝到 PCR 反應(yīng)管中，20μL/管。

3.  加樣（樣本處理區(qū)）

將步驟 1 提取的核酸、陽性質(zhì)控品、陰性質(zhì)控品各取 5μL，分別加入相應(yīng)的反應(yīng)管中，蓋好管蓋，混勻， 短暫離心。

4.  PCR 擴(kuò)增（核酸擴(kuò)增區(qū)）

4.1  將待檢測反應(yīng)管置于熒光定量 PCR 儀反應(yīng)槽內(nèi)；

4.2  設(shè)置好通道、樣品信息，反應(yīng)體系設(shè)置為 25μL；

熒光通道選擇： 檢測通道（Reporter Dye）FAM， 淬滅通道（Quencher Dye）NONE，ABI 系列儀器請勿選擇

ROX 參比熒光，選擇 None 即可。

4.3  推薦循環(huán)參數(shù)設(shè)置：

5.1  結(jié)果分析條件設(shè)定（請參照各儀器使用說明書進(jìn)行設(shè)置，以分析 ABI7500 儀器為例）

反應(yīng)結(jié)束后自動保存結(jié)果，根據(jù)分析后圖像調(diào)節(jié) Baseline 的 Start 值、End 值以及 Threshold 值（用戶可根據(jù)實際情況自行調(diào)整，Start 值可設(shè)在 3～15、End 值可設(shè)在 5～20，使閾值線位于擴(kuò)增曲線指數(shù)期，陰性質(zhì)控品的擴(kuò)增曲線平直或低于閾值線），點擊 Analyze 自動獲得分析結(jié)果。

5.2  結(jié)果判斷

陽性：檢測通道 Ct 值≤40，且曲線有明顯的指數(shù)增長曲線； 陰性：樣本檢測結(jié)果 Ct 值>40 或無 Ct 值。

5.3  質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)

陰性質(zhì)控品：無特異性擴(kuò)增曲線或無 Ct 值顯示；

陽性質(zhì)控品：擴(kuò)增曲線有明顯指數(shù)增長期，且 Ct 值≤32； 以上條件應(yīng)同時滿足，否則實驗視為無效。

6.  檢測方法的局限性

1. 樣本檢測結(jié)果與樣本收集、處理、運送以及保存質(zhì)量有關(guān)；

2. 樣本提取過程中沒有控制好交叉污染，會出現(xiàn)假陽性結(jié)果；

3. 陽性對照、擴(kuò)增產(chǎn)物泄漏，會導(dǎo)致假陽性結(jié)果；

4. 病原體在流行過程中基因突變、重組，會導(dǎo)致假陰性結(jié)果；

5. 不同的提取方法存在提取效率差異，會導(dǎo)致假陰性結(jié)果；

6. 試劑運輸，保存不當(dāng)或試劑配制不準(zhǔn)確引起的試劑檢測效能下降，出現(xiàn)假陰性或定量檢測不準(zhǔn)確的結(jié)果；

7. 本檢測結(jié)果僅供參考，如須確診請結(jié)合臨床癥狀以及其他檢測手段。

【注意事項】

1. 所有操作嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行；

2. 試劑盒內(nèi)各種組分使用前應(yīng)自然融化，wan全混勻并短暫離心；

3. 反應(yīng)液應(yīng)避光保存；

4. 反應(yīng)中盡量避免氣泡存在，管蓋需蓋緊；

5. 使用一次性吸頭、一次性手套和各區(qū)專用工作服；

6. 樣本處理、試劑配制、加樣需在不同區(qū)進(jìn)行，以免交叉污染；

7. 實驗完畢后用 10%次氯酸或 75%酒精或紫外燈處理工作臺和移液器；

8. 試劑盒里所有物品應(yīng)視為污染物對待，并按照《微生物生物醫(yī)學(xué)實驗室生物安全通則》進(jìn)行處理。

【參考文獻(xiàn)】

[1] 中華人民共和國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部(2018).GB/T 18637-2018.國家市場監(jiān)督管理總局;中國國家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會.